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近年來，隨著分子生物學技術的發展，對各種代謝性疾病的基因定位和基因表達調控特征研究越來越多，通過PCR、基因芯片等技術方法進行遺傳代謝病的基因診斷已成為可能，也使該類疾病的診斷從傳統的表型診斷步入真正的病因診斷新階段。對遺傳代謝缺陷病進行及時篩查診斷并正確治療，是衡量一個國家醫學發展水平的重要指標。
(一)基因診斷的概念和特點
所謂基因診斷，就是利用現代生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測基因結構及表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法?；蛟\斷是繼形態學、生物化學和免疫學診斷之后的第四代診斷技術，它的誕生與發展得益于分子生物學理論和技術的迅速發展，更多先進、簡便的基因診斷方法也不斷涌現。
相對于傳統的表型診斷，基因診斷具有以下特點：①以基因作為檢查材料和探查目標，針對性強；②分子雜交選用特定基因序列作探針，故特異性強；③分子雜交和PCR具有放大效應，故有較好的靈敏度；④適用性強，檢查目標可以為內源基因，也可以為外源基因，診斷范圍廣。
(二)常用基因診斷技術
分子生物學技術很多，目前已有20種可以用于基因診斷。這些技術既包括一些傳統的突變分析技術，如單鏈構象異構多態分析技術、異質性雙鏈構象多態性分析、錯配裂解法、變性液相色譜分析、等位基因特異性寡核苷酸雜交、等位基因特異性擴增等，也包括核酸分子雜交、：DNA測序、PCR擴增、基因芯片等許多新的技術方法及其聯合。
1．分子雜交技術具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的溫度和離子強度下，根據堿基互補的原則退火形成穩定的異源雙鏈。根據這一原理，可以用己知核酸片段作為探針并加以標記，用于檢測未知序列。分子雜交的過程是高度特異性的，可應用于基因克隆的篩選和酶切圖譜的制作、基因組中特定序列的定量和定性檢測、基因突變分析。根據檢測物質的不同，分子雜交可以分為Southem雜交、Northem雜交、Dot雜交和Western雜交，分別用于檢測特定的DNA、RNA和蛋白質。
2． PCR技術 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)又稱體外基因擴增技術，是通過引物和靶DNA的變性處理，在DNA聚合酶的作用下，以靶DNA為模板，合成引物之問的DNA片段，是一個由溫度控制反復進行熱變性、退火、引物延伸3個步驟而擴增DNA的循環過程。近些年來，PCR技術不斷發展，各種方法層出不窮，例如強化PCR、膜結合PCR、錨定PCR、錯配PCR、原位PCR、彩色PCR、反向PCR、不對稱PCR、增效PCR、定量PCR和重組PCR等。而PCR與限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLPs)、特異性寡核苷酸探針斑點雜交(ASO)、單鏈DNA構象多態性(SSCP)、異源雙鏈分析法(HA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等其他技術相結合形成的新方法，使PCR技術的實用性得到了延伸、補充和發展。
3．DNA測序技術 DNA測序技術是人類探知大自然和生命奧秘的重要武器，也是遺傳代謝病基因診斷的基本方法，具有穩定、簡便、重復性好、自動化程度高等優點。Sanger雙脫氧鏈中止法是zui常用的測序方法，其基本原理是用放射性同位素標記引物，用雙脫氧核苷酸終止DNA鏈的延伸，產生長度不等的DNA片段，再由高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影讀取結果。在各種篩選方法的敏感性和特異性受*，DNA測序無疑是突變分析zui重要的方法?，F在的直接測序方法用四色熒光標記代替了放射性同位素標記。目前型的全自動遺傳分析儀自動化程度高、通量大，檢出率可達到1000/0，可重復性達到100%。對于短序列的片段分析，也可采用焦磷酸測序技術。
4．熒光原位雜交技術熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是用生物素或地高辛等非放射性物質標記探針，根據堿基配對原則進行雜交，并通過熒光素偶聯的抗原-抗體檢測系統，在組織、細胞及染色體上對DNA或RNA進行定性及定位分析的一種技術。FISH技術經不斷改革和完善，己衍生為一系列包括染色體涂染、間期熒光原位雜交、多色熒光原位雜交和DNA纖維熒光原位雜交等FISH技術，在基因制圖、染色體進化、先天畸形診斷、腫瘤診斷和產前診斷等方面都得到了廣泛的應用。
5．基因芯片技術基因芯片技術是建立在雜交測序理論基礎上的一種全新技術，是將許多特定的基因片段有規律地排列固定于支持物上，然后通過與待測的標記樣品按堿基配對原理進行雜交，再通過檢測系統對其進行掃描，并用相應的軟件對信號進行比較和檢測，得到所需的大量信息，進行基因高通量、大規模、平行化、集約化的信息處理和功能研究。
基因芯片技術的出現使基因序列測定、基因功能測定等工作的程序得到了極大的簡化。該項技術已經在基因多態性分析、基因表達分析等多方面得到了廣泛的應用，并已應用于臨床診斷。例如，一種可檢測已知突變的芯片，可同時檢測117種常見的LDL-R基因點突變和Apo B100基因在3500位點的突變，1180個經：DNA測序證實存在突變的家族性高膽固醇血癥(FH)患者采用該芯片檢測全部得到相同結果，特異性和敏感性分別達99.7%和99.9%。
6．多重連接探針擴增技術 多重連接探針擴增技術(multiplex 1igation-dependentprobeamplification，MLPA)是利用核酸雜交、連接反應和PCR擴增反應，可以在同一試管內檢測多達45個不同核酸序列拷貝數變化，已廣泛應用于染色體異常、基因點突變、基因缺失突變等研究領域。其優點為靈敏度高、專一性強、相對簡單、成本低、高處理速度等。多重連接探針擴增技術可檢測出基于外顯子測序分析方法檢測不到的基因突變，有可能成為一種新的遺傳代謝病分子診斷工具。
(三)遺傳代謝病的基因診斷策略
基因診斷可分為直接診斷和間接診斷。直接診斷是以基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產物，以探查基因本身有無突變、缺失等異常及其性質，它適用于已知基因異常的疾病。而當致病基因未知或致病基因異常未知時，可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體，這稱為間接基因診斷。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態性位點，特別是基因突變部位或緊鄰的多態性位點作為標記。
1．基因診斷方法的選擇各種遺傳病的基因異常不同，要根據致病基因的變化方式選擇相應的基因診斷方法。
遺傳代謝病的基因異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。后者包括單個堿基置換、微小缺失或插入。近年來不斷發現一些遺傳病是由于基因內的三核苷酸重復順序增加引起的，根據對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴增直接檢測；點突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢測。一般無需對家系成員進行分析。但條件是必須知道基因異常的性質，并肯定該異常與疾病之間的關系。然而，由于許多疾病的遺傳異質性，以及多數遺傳基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。
許多遺傳病的基因尚未分離克隆，或基因異常尚不清楚，因此還不能根據突變的性質進行診斷。但如果通過家系分析能證明某一DNA標記與致病基因連鎖，則凡帶有該標記的成員都可能帶有致病基因，從而可作出間接的連鎖分析診斷。
2．基因診斷策略的確定
(1)基因缺失型遺傳代謝病的診斷：可以采用核酸雜交、基因測序、基因芯片、PCR/RFLP等多種方法進行。例如，a-地中海貧血主要是由于血紅蛋白a基因缺失引起的一種遺傳代謝病。正?；蚪M用BamHI切割，可以得到一個14kb的片段，而缺失一個a基因時切點向5’端移位，得到一條10kb的片段。因此，當用a基因探針與基因組DNA進行Southern雜交時，正常人可見一條雙份的14kb的帶，在a-地中海貧血患者則可見一條14kb和一條10kb的帶，或者一條單拷貝的14kb的帶，血紅蛋白H病時只有一條10kb的帶，而在。Bats水腫胎時，則無任何雜交帶。
(2)點突變型遺傳病的基因診斷：常用PCR、RFLP和ASO探針等進行。例如，鐮形細胞性貧血已知突變基因是編碼β-珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變為GTG，從而使纈氨酸取代了甘氨酸，因此，可用RFLP進行基因診斷。已知限制酶MstⅡ切割的識別順序是CCTNAGG，它能切割正常β鏈中的CCTGAGG序列，但不能切割突變了的CCTGTGG(A→T)。這樣，由于突變消除了一個切點，使內切酶長度片段發生了改變，通過電泳，就可以區別正常的βA和βS。由于突變部位和性質已*明了，也可以合成寡核苷酸探針，用32P標記后用ASO探針進行診斷。
(3)基因異常不明的遺傳病的診斷：這類遺傳代謝病大多通過連鎖分析進行間接診斷。
例如，成年型多囊染色體顯性遺傳病，發病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現多發性囊腫，臨床表現為腰痛、蛋白尿、血尿、高血壓、腎盂腎炎、腎結石等，zui終可導致腎功能衰竭和尿毒癥。本病基因定位于16p13，與a-珠蛋白基因3’端相鄰，但致病基因尚未克隆，基因產物的生化性質和疾病發病機制也尚未闡明。因此，只能用連鎖分析進行基因的發病前診斷和產前診斷。
隨著基因組學和蛋白質組學的飛速發展，遺傳代謝病的病因學研究和基因診斷也越來越深入。分子診斷學在該領域未來的發展方向是發揮其在疾病預測、預防和個體化治療中的作用，充分發揮分子診斷在克服耐藥性治療中所起到的不可替代的作用，同時必須關注分子診斷中的醫學倫理和生物安全問題，并加強基因診斷技術的質量控制。
參考資料：骨代謝異常的生物化學檢驗
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